Меню

Стерилизация аппаратуры и коммуникаций



Курс лекций по биотехнологии — часть 14

Если источником целевого продукта является микроорганизм (например, при
производстве антибиотиков), то для его культивирования обязательны
асептические условия, соответствующее оборудование и специальная
подготовка к проведению процесса.

микроорганизмов-рекомбинантов, которое требует усиленного контроля за
стабильностью продуцента, и, кроме того, тщательного и постоянного
соблюдения мер, предотвращающих возможность попадания этого
биообъекта в окружающую среду. Такие меры предусматривают
использование специального оборудования и соблюдения определенных
правил, относящихся непосредственно к технологическому режиму.

В современном биотехнологическом производстве наиболее частым

биообъектом, то есть продуцентом целевого продукта, является штамм
микроорганизма, выращиваемый в специальных ферментационных аппаратах
(ферментерах или ферментаторах) различных типов (рис.10). Ферментер
снабжен приспособлениями (так называемая «обвязка» ферментера),
позволяющими создавать оптимальные условия для роста биообъекта и
биосинтеза целевого продукта (не всегда эти условия совпадают).

Ферментационные аппараты, используемые фармацевтической

промышленностью, в основном, изготавливаются из нержавеющей стали. Их
объем варьирует от нескольких десятков до нескольких сотен кубометров.
Обычно ферментер, установленный в цехе ферментации, выглядит как
вертикально расположенный цилиндр с полукруглым дном, в котором
имеется приспособление для слива культуральной жидкости. В верхней
части ферментера имеется полукруглая крышка с рядом входных устройств
(вводов): для питательной среды, для посевного материала, для
пропускаемого через специальное устройство воздуха (аэрация) и выходного
устройства для вывода воздуха, прошедшего через толщу питательной
среды и т.д. В центре ферментера по его вертикальной оси находится
мешалка (одноярусная, многоярусная), обеспечивающая массообмен. Во
внутреннем пространстве ферментера находятся «отбойники»,
предотвращающие возникновение «застойных» (мертвых) зон при работе
мешалки. Этим обеспечивается равномерность концентрации растворимых
веществ и коллоидных частиц в среде.

Источник

ОСОБЕННОСТИ КОНСТРУИРОВАНИЯ И РАБОТЫ ФЕРМЕНТАЦИОННОГО ОБОРУДОВАНИЯ

Стерилизация ферментера и сохранение асептики.

Важнейшим условием успешного протекания любого биотехнологи- ческого процесса является поддержание стерильности среды в ферментере и во всей ферментационной установке в целом.

Всю совокупность операций по подготовке оборудования и коммуникаций с целью создания в них асептических условий можно разделить на два важнейших процесса: стерилизация внутренних полостей и герметизация всех элементов и узлов. Первый процесс проводится в подготовительный период перед запуском оборудования (в ходе процесса ферментации осуществляются лишь профилактические мероприятия по стерилизации отдельных узлов вспомогательного оборудования). Второй процесс осуществляется и при подготовке, и при эксплуатации оборудования.

Наиболее распространенный метод стерилизации аппаратов и трубо- проводов — тепловая обработка перегретым выше 100 0 С насыщенным водяным паром. Этот метод надежнее, экономичнее и удобнее в производственных условиях, чем обработка химическими средствами.

При стерилизации важнейшим условием ее эффективности является возможность создания во всех точках внутренних полостей необходимой температуры и поддержания ее в течение заданного времени. В производственных условиях выполнение этого требования связано со значительными трудностями ввиду наличия в ферментере многочисленных тупиковых полостей, областей и зон в которые затруднен доступ пара (“слабые точки”). Наиболее трудно стерилизуемыми местами в аппаратах являются участки расположения теплообменников, барботеров, штуцера (места ввода трубопроводов, датчиков КИП), загрузочные люки, а в разводках трубопроводов — тупиковые места, которые образуются на ответвлениях и в местах присоединения к аппаратам.

Расчетным путем показано, что для достижения равной степени стери-лизации в перечисленных «слабых» точках и в основном обьеме аппарата продолжительность выдержки различается примерно в 100 раз, если принять температуру пара в них 100 С.

Наличие большого количества “слабых точек” обусловлено тем, что конструкционные решения большинства узлов промышленного ферментера часто заимствуются из химической технологии и поэтому они не соответствуют требованиям стерилизации.

Наиболее действенной мерой повышения эффективности стерилизации оборудования и коммуникаций является разработка оборудования с наименьшим числом таких «слабых» точек или принудительная подача пара в эти зоны через дополнительные термические затворы, специально встроенные в те участки ферментера, где наблюдается максимальная концентрация таких«слабых» точек. Так же такими термическими затворами должны быть снабжены и все трубопроводные линии аппаратов.

Химические методы стерилизации, несмотря на свою эффективность, применяются редко. Это связано с тем, что после окончания стерилизации необходимо удалить стерилизующий агент, а это достаточно трудно сделать и может привести к повторной контаминации. Наиболее удобно использование газообразных или легколетучих веществ (этиленоксид, β-пропиолактон), которые легко удалить продувая систему стерильным воздухом.

Второй процесс определяющий конструктивные особенности аппара-туры, — ее герметизация. Она решает две задачи — защиту внутреннего объема от посторонней микрофлоры и защиту окружающей среды от продуктов биосинтеза.

Проблема обеспечения герметичности обусловлена рядом причин: пара- метры проведения разных стадий технологического процесса резко различаются (например термическая стерилизация (100 0 С и выше) и культивирование (25-45 0 С), сильная вибрация при работе перемешивающих устройств, перепад температуры в различных зонах установки, все это приводит к возникновению трещин и щелей в конструкциях и узлах аппаратуры.

Большинство случаев дегерметизации приходится на запорную арматуру, в которой наиболее опасные места — уплотнение седло-клапан и уплотнение штока, на фланцевые соединения, уплотнение валов и мешалок и места ввода датчиков КИП.

Одним из важных направлений повышения эффективности герметизации является переход на сварные соединения вместо фланцевых (соединение отдельных узлов за счет болтов), на сильфонные или мембранные вентили вместо обычных, на создание торцевых уплотнений для валов перемешивающих устройств с контролируемой герметичностью.

Читайте также:  Установка фары искателя УАЗ 469

Для снижения риска попадания извне посторонней микрофлоры внутри ферментера создают небольшое избыточное давление.

В зависимости от требований предъявляемых к чистоте продукции (лекарственные, пищевые продукты) проводят работы по дезинфекции рабочих мест и целых производственных участков, очистке воздуха рабочих зон.

Термостатирование

Обеспечение оптимальной температуры процесса культивирования является одной из самых сложных и ответственных технических проблем. На практике теплоотвод связан с большими капиталовложениями и необходимостью строительства сложных систем оборотного водоснабжения, теплообменных устройств в ферментерах, а иногда и дополнительных холодильных установок. Затраты на теплоотвод соизмеримы с затратами на обеспечение клеток кислородом (аэрирование, перемешивание) и поэтому они могут быть решающими при выборе конструкции ферментера.

Проблема обусловлена следующими причинами:

а) низким коэффициентом теплопередачи (малой теплопроводностью) клеточной стенки, и как следствие малоинтенсивной теплоотдачей со стороны микробной суспензии, а также с образованием отложений клеток на внешней стороне охлаждающих элементов. Малый коэффициент теплопередачи объясняется так же практически ламинарным обтеканиием вязкой микробной суспензией поверхности охлаждающих элементов;

б) небольшой величиной движущей силы теплопереноса, т.е. перепада температур между охлаждающей водой (в летнее время 26-28 С) и микробной суспензией (обычно 32-34 С);

в) необходимость отводить не только тепло, выделяющееся при жизне- деятельности микроорганизмов, но и все тепло, которое выделяется при работе перемешивающих устройств за счет трения слоев жидкости друг о друга и о стенки и внутренние узлы аппарата;

В зависимости от тепловой нагрузки для отвода тепла используют поверхность корпуса аппарата (тепловые рубашки) или встроенные внутрь аппарата теплообменники змеевикового типа. Наилучшим решением проблемы является использование выносных теплообменников (кожухотрубных, пластинчатых), располагаемых на внешних циркуляционных трубах, если такие имеются.

При использовании встроенных теплообменников очень важно правильно выбрать место их размещения, чтобы можно было обеспечить интенсивный циркуляционный поток жидкости. Всегда необходимо помнить, что встроенные теплообменники повышают вероятность инфицирования ферментеров (дополнительные “слабые” точки), ухудшают гидродинамический режим, уменьшают полезный объем, усложняют их промывку, стерилизацию и

Пеногашение

Большинство микробиологических процессов сопровождается интенсив-ным выделением различных газов (CO2, H2, CH4 и др.), что часто приводит к обильному пенообразованию. Это является крайне нежелательным процесс-сом, так как чрезмерное вспенивание в ферментере ограничивает полезную емкость аппарата, нередко является причиной заражения среды посторонней микрофлорой, приводит к потерям культуральной жидкости, уходящей с пеной из аппарата. В большинстве случаев пеногашение осуществляют с помощью добавления химических пеногасителей — поверхностно-активных веществ природного и химического происхождения. Однако в последнее время все больше внимания обращается на механические пеногасители, использование которых исключает или резко сокращает введение химических пеногасителей, которые иногда бывают токсичными для микроорганизмов-продуцентов или являются ингибиторами ферментов.

Все механические пеногасители разделяются на два типа — роторные и циклонные. Принцип действия механических пеногасителей заключается в разрушении пузырьков воздуха или их дроблении при контакте с рабочим органом. Применяются как встроенные в аппарат, так и выносные механические пеногасители.

В случае роторных пеногасителей рабочим органом является обычно вращающийся диск с лопастями, выступами, прорезями либо пакет кони-ческих сепарационных тарелок.

Довольно широко используются пеногасители циклонного типа. Поступающая из аппарата воздушно-пенная струя двигается по винтовому каналу в верхней части циклона и после попадания в полую нижнию часть его закручивается как в вихре. В результате жидкость собирается в центе вихря и падает вниз, удаляясь через нижний патрубок, а воздух уходит через верх. Наилучший эффект в этом случае достигается обычно при их совместном использовании с химическими пеногасителями.

Контроль и управление процессами культивирования.

Основное искусство технолога при проведении управляемого культивирования состоит в умении создать наиболее «комфортные» условия для растущей культуры. Для этого необходимо прежде всего знать, каковы они — эти условия, или иными словами:

а) состояние процесса в пределах бесконечно малого промежутка времени;

б) реакцию микроорганизмов на любые изменения подвергаемых измерению и контролируемых параметров процесса.

Однако непосредственно изучить состояние (“самочувствие”) клеток в промышленном аппарате не представляется возможным. Поэтому физиологическое состояние культуры продуцента оценивается обычно косвенно по различным кинетическим параметрам: скорости роста, потребления кислорода и различных субстратов, выделению углекислого газа и других продуктов метаболизма (в том числе и целевых), скорости закисления или защелачивания (по значению рН), тепловыделению и т.д.

Основными управляющими воздействиями для поддержания и корректировки режима культивирования являются режим аэрации и перемешивания, подача теплоносителя, регулировка величины рН, поддержание уровня пены, скорость дозирования субстрата.

Одной из основных проблем промышленной биотехнологии является отсутствие специализированных датчиков, поскольку общепромышленная номенклатура приборов и средств автоматизации, зачастую, не соответствует асептическим условиям процессов, не выдерживает многократной термической стерилизации, не может работать в сложных по составу ферментационных средах, включающих биомассу, пузыри воздуха, жировые компоненты, жидкие эмульсии и твердые частицы.

Дозирование субстратов. Как уже отмечалось насосы, трубопроводы и запорная арматура- сплошная “слабая” точка. В условиях асептических производств лучшими дозирующими насосами являются перистальтические или мембранные в которых рабочий орган взаимодействует с жидкостью через непроницаемую мембрану. Возможно дозирование и без насосов, с помощью дозировочных бачков. При этом давление в линиях должно на 1,5-2 атм превышать давление в ферментере.

Концентрация водородных ионов. Измерение рН без особых проблем осуществляют с помощью стеклянных электродов сравнения, которые хорошо выдерживают паровую стерилизацию. Иногда используют выносные системы с циркуляцией через них жидкости из ферментера.

Читайте также:  7 способов прокладки волоконно оптического кабеля

Концентрация растворенных газов. Наибольшее распространение полу-чили амперометрические датчики. Они выдерживают 20-кратную стерили-зацию, не теряя чувствительности. Однако перед началом процесса ферментации они нуждаются в градуировке. Наиболее широко такие датчики используются на определение количества растворенного кислорода.

Концентрация CO2 в выхлопных газах. Этот параметр обычно измеряется по теплопроводности газов при помощи катарометра. Иногда пользуются инфракрасными анализаторами.

Температура. При биосинтезе температура может изменяться по определенной программе, обеспечивающей максимальный выход продукта. Температуру можно контролировать ртутными термометрами, термопарами или металлическими термометрами сопротивления.

Давление. Для измерения этого параметра используют относительно простые диафрагмовые манометры, способные работать в условиях стерильности. Результирующий пневматический сигнал может быть реализован непосредственно на исполнительном устройстве или преобразован в электронный. Давление в ферментере обычно регулируется простым клапаном обратного давления.

В случае аварийного выключения компрессора, сопровождающегося падением избыточного давления в ферментере, необходимо загерметизировать аппарат для защиты от внешней посторонней микрофлоры. Для этого манометр в ферментере соединяется в единую схему с заслонками на линии ввода и вывода газа и в случае падения давления ниже допустимого эти заслонки автоматически закрываются.

Скорость подачи газа и жидкости. Предпочтение обычно отдается расходомерам переменного сечения — ротаметрам и диафрагмам. Положе-ние поплавка в ротаметре трансформируется в электрический сигнал, который передается на регулятор, управляющий вентилем на трубопроводе.

Уровень жидкости в ферментере. Интенсивное перемешивание и пенообразование не позволяют применять обычные методы измерения уровня, распространенные в химической технологии (смотровые окна, мерные трубки и тд.).

В ферментерах и биореакторах целесообразно применять весовой тип уровнемера, в котором датчики, фиксирующие массу аппарата, передают свой сигнал на прибор, отградуированный в единицах уровня.

Источник

Стерилизация питательных сред

Герметизация и стерилизация оборудования

Асептические условия производства требуют стерилизации перед началом процесса всей аппаратуры (изнутри) и всех материальных потоков. Этого, однако, недостаточно. Стерильность должна быть сохранена в течение всего рабочего цикла. Иными словами, технологический процесс должен быть защищен от контаминации за счет обеспечения герметичности всех соединений в аппаратуре.

В монтажной схеме любого ферментера имеется несколько десятков разного рода герметизирующих элементов. Наиболее распространенные из них – фланцевые соединения и запорная арматура уязвимы в отношении герметичности при монтаже с обвязкой ферментера.

В системах, работающих в асептических условиях, должна быть обеспечена возможность стерилизации всех точек внутренних объектов аппаратов и коммуникаций. Для этого перед загрузкой ферментеров через них пропускают насыщенный водяной пар под давлением. Однако здесь существуют свои сложности. Это касается, например, открытых трубных окончаний – участков труб, одним концом соединенных полостью ферментера, а другим соприкасающихся с атмосферой. К ним относятся узел отвода отработанного, т.е. прошедшего через ферментер, воздуха и узлы отбора проб.

Повышенное давление в открытом трубном окончании создать невозможно, следовательно, и температура там будет не выше 100ºС. Из-за этого приходится увеличивать продолжительность обработки. Обычно в трубе делают вырезку, и во время работы пар непрерывно подается в открытое трубное окончание. В случае так называемых «тупиковых полостей» трудно обеспечить вытеснение воздуха и циркуляцию пара. Обычно в трубопровод врезают два вентиля, между которыми – подвод пара и отвод образующегося конденсата.

Промышленные ферментеры большого объема стерилизуют в течение часа при 125-130 ºС.

Используемые в промышленности среды (как правило, жидкие комплексные, реже синтетические) стерилизуются тепловым методом (насыщенным паром).

Устойчивость микроорганизмов к тепловому воздействию определяется многими факторами, в частности видовой принадлежностью микроорганизма. Учитывается, что споры гораздо устойчивее к нагреванию, чем негативные клетки. На эффективность тепловой стерилизации влияет количество клеток в среде: чем их меньше, тем легче достигается стерилизующий эффект. Из этого следует, что перед стерилизацией необходимо понижать количество микробных клеток в среде.

Определяющее значение при тепловой стерилизации имеют температура и время ее поддержания. Чем выше температура, тем быстрее достигается стерилизующий эффект. Для оценки эффективности процесса стерилизации используют физические (по температуре и давлению пара), химические (по температуре плавления или изменению цвета), микробиологические (с высевом на стандартные среды), биоиндикаторные (с использованием Bacillus stearothermophilus) методы.

При тепловой стерилизации помимо гибели контаминирующих микроорганизмов могут разрушаться термолабильные вещества среды: витамины ферменты, некоторые аминокислоты. С этим явлением, ухудшающим качество питательных сред, борются, повышая температуру и уменьшая время стерилизации.

Тепловая стерилизация жидкостей выполняется двумя способами: периодическим и непрерывным. При периодическом способе стерилизация происходит в самом ферментере. Одновременно нагревается весь объем жидкости (среды) до температуры стерилизации, которая выдерживается определенное время, после чего понижается до заданной. Этот способ прост и применяется в случае небольших аппаратов. Его недостатки: значительный градиент температуры по объему и «недостерилизация» в тупиках. При непрерывном способе (более прогрессивном и производительном) стерилизация осуществляется в специальных установках.

В результате температуру можно увеличить до 130-150 ºС; при этом время стерилизации уменьшается до 3-10 мин, что положительно сказывается на качестве среды.

Недостатком в данном случае является увеличение протяженности трубопроводов, что повышает вероятность вторичной контаминации.

Для стерилизации биореакторов применяют пар под давлением. Внутри биореактора не дожно быть «мертвых зон», недоступных для пара во время стерилизации. Стерилизации подлежат все клапаны, датчики, входные и выходные отверстия.

Читайте также:  Контроль работы оборудования это

Стерильность обеспечивается и герметизацией биотехнологического оборудования, работающего в асептических условиях. Стерильнаяя передача жидкости осуществляется через штуцеры парового затвора. Технологическая обвязка биореактора исключает контаминацию культуральной жидкости посторонней микрофлорой и возможности поподания продуктов биосинтеза в окружающую среду. Основные агенты, контаминирующие клеточные культуры – бактерии, дрожжи, грибы, простейшие, микоплазмы, вирусы. Источники контаминации – воздух, пыль, питательные среды, рабочие растворы, оборудование, рабочий персонал.

Очистка воздуха от микроорганизмов и аэрозольных частиц осуществляется через фильтры предварительной очистки ( комбинированные глубинные фильтры – бумага, картон, тканевые материалы), которые устанавливают на всасывающей линии перед компрессором (воздух очищается от частиц размером более 5мкм) и фильтры тонкой очистки ( ткань ФП, удаляющая частицы размером до 0,3 мкм, металлокерамические и мембранные фильтры).

Металлокерамические фильтры изготовлены из калиброванных металлических порошков (бронзы, никеля, нержавеющей стали, титана) способами спекания, прессования, прокаты; размер опр варьирует от 2 до 100 мкм. Металлокерамические филтры стерилизуют при температуре 150 С 50 мин. Они стойки к действию сильных кислот, щелочей, окислителей, спиртов, могут использоваться при температуре от -250 С до +200 С.

Преимущество металлокерамических фильтрующих элементов – простота регенерации, большой срок работы (5-10 лет). В отличие от волокнистных, нетканных и фторопластовых фильторов, зернистые металлокерамические материалы имеют неизменную структуру, химически инертны, поддаются любым методам стерилизации, отличаются высокой мехонической почностью, просты в изготовлении.

Мембранные фильтры патронного и кассетного типа несмотря на менее значительный срок службы (1 год) обладают высокой эффективностью, быстрой съемностью, надежны в работе. Отмечена способность рядом фильтрующих материалов, заряженных отрицательно, задерживать живые клетки, бактерии, вирусы, эритроциты, лимфоциты и тромбоциты. Частицы, размер которых меньше величины пор фильтрущего материала, остаются на фильтре, если дзета-потенциал (электрический потенциал) частиц и стенок пор фильтра имеет противоположные заряды. Это явление наблюдается при использовании в качестве фильтрующих элементов мембран с соответствующими электростатическими свойствами. Выбор фильтрующего материала зависит от объекта фильтрации и дзета-потенциала суспендированных частиц.

Отработанный воздух, отводимый из лабораторных и производственых помещений, контролируется на чистоту (отсутствие микроорганизмов).

Для обслуживания установок глубинного культиривирования применяют автоматизированную модульную систему, включающую:

— очистка и стерилизация воздуха и пара с использованием металлокерамических и титановых фильтрующих элементов;

Источник

Стерилизация аппаратуры и коммуникаций

При поверхностном культивировании стерилизуют аппаратуру для приготовления посевного материала (емкости для засева кюветы, емкости для воды, для приготовления посевной суспензии, посевные коммуникации), а также производственные кюветы.

Помещения, особенно посевные боксы, стерилизуют облучением с помощью специальных бак­терицидных ламп.

Стерилизация аппаратов и коммуникаций имеет большое значение и при глубинном способе культивирования. Самая тщательная стерилизация может не дать эффекта, если нарушена герме­тичность оборудования. Созданы специальные приборы, например, гаплоидные течеискатели, для обнаружения даже незначительных нарушений герметичности.

При стерилизации оборудования есть опасность даже при высоких температурах не добиться стерильности в результате того, что в процессе тепловой обработки внутренних полостей аппаратов происходит конденсация пара у стенок. Воздух, выделяющийся из парогазовой смеси, покрывает стенки аппарата воздушной пленкой, в результате чего условия нагревания стенки ухудшаются. Плохо поддаются стерилизации различные патрубки и люки, так как в них образуются воздушные пробки. Для улучшения условий стерилизации при конструировании аппаратуры следует сокра­щать число впаев, увеличивать диаметр и уменьшать высоту отводящих и подводящих штуцеров.

Все вентили перед установкой проверяют гидравлическим спрессовыванием при давлении 0,3 МПа. Для герметизации фланцев и вентилей используют особые прокладки из паранита, обра­ботанного графитом, для герметизации крышек аппаратов применяют шнур из прорезиненной ткани диаметром до 19 мм, а для загрузочных люков — резину толщиной 14 мм.

Перед заливом среды тщательно проверяют сальниковое уплотнение мешалки, так как в про­цессе стерилизации плотность насадки может измениться.

Особое внимание уделяется стерилизации аппаратуры и коммуникации для подачи пеногасите­ля. Стерилизацию этих узлов проводят при 125-135 °С в течение 1,5-2 ч.

Рис. 7. Схема очистки и стерилизации воздуха для поверхностного культивирования продуцентов I растилъная камера; 2 — распределитель воздуха; 3 — стерилизующие колонки; 4 — бак для стерилизации воды; 5 бачок для формалина; 6 — бачок для аммиака; 7 — насос для подачирецикуляционной воды к форсункам оросительной камеры; 8 — кондиционер воздуха; 9 — вентилятор; 10 — спаренные клапаны с автоприводом;

11 перфорированные трубы для подвода пара; 12 — охлаждающий змеевик; 13 — вентиляторы осевые;

14 — форсунки для увлажнения; 15 — паровые форсунки для дезинфекции; 16 — калориферы;

17 система фильтров для воздуха, поступающего из атмосферы; 18 — система фильтров для отработанного

воздуха, выбрасываемого в атмосферу

Рис. 8. Схема очистки и стерилизации воздуха для глубинного культивирования продуцентов 1 — висциновые фильтры; 2 — маслоотделитель; 3 — холодильник; 4 — ресивер; 5 — поршневой компрессор;

6 — турбокомпрессор; 7 — головные фильтры; 8 — индивидуальный фильтр;

9 — фильтр для отработанного воздуха

На стадии стерилизации ведется постоянный микробиологический контроль стерильности пи­тательной среды, подаваемого в ферментатор воздуха, пеногасителя и др.

На микробиологическую чистоту проверяют отделение стерилизации, его стены и пол, аппара­туру, коммуникации, а также руки работающих.

Рис. 9. Фильтр цилиндрический с тканью Петрякова 1 — штуцер для входа воздуха;

2 — крышка на 12 откидных вин. max; 3 — корпус;

4 — стакан; 5 — кран для подвода паров формалина;

Источник